在二代測序基礎(chǔ)上發(fā)展起來的RAD-seq技術(shù)是一項基于全基因組酶切位點的簡化基因組測序技術(shù)。由于特異性酶切位點在全基因組范圍內(nèi)廣泛分布，通過RAD-seq能夠在大多數(shù)物種內(nèi)獲得數(shù)萬至數(shù)十萬的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上，RAD-seq技術(shù)又衍生出多種簡化基因組測序方法，包含GBS，ddRAD，ezRAD以及2b-RAD等。其中，ddRAD-seq通過一個稀有酶與一個常見酶相結(jié)合對基因組DNA進(jìn)行雙酶切，免去隨機(jī)打斷的過程，是一種非常有前景的簡化基因組測序技術(shù)。不過，ddRAD技術(shù)雖然在建庫流程上比RAD做了一定程度的簡化，但仍然包括12步，實驗耗時較長。因此，有必要對現(xiàn)有的ddRAD簡化基因組測序文庫構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn)，以克服其需要多次選酶、使用儀器復(fù)雜、成本偏高等缺陷，提高測序效率。

　　中國科學(xué)院昆明植物研究所博士研究生楊國騫在郭振華研究員與李德銖研究員指導(dǎo)下，與中科院海洋研究所李莉研究組一起，開發(fā)出一種被子植物中通用的雙酶切簡化基因組（Modified ddRAD，簡稱MiddRAD）二代測序文庫構(gòu)建方法。該方法首先發(fā)現(xiàn)一種被子植物通用酶切組合“AvaII + MspI”，減少了不同物種間需要多次選酶的步驟；其次，該方法將復(fù)雜的建庫專用儀器優(yōu)化為通用的分子生物學(xué)儀器；再次，該方法將P1測序接頭由37個堿基簡化為25個堿基（barcode按5個堿基計算）并設(shè)計出一套新的barcode-adapter體系；最后，該方法還減少了純化酶切產(chǎn)物、連接前定量及混樣后純化連接產(chǎn)物的步驟，簡化了建庫流程，允許僅使用50ng DNA即可完成文庫構(gòu)建。該技術(shù)操作簡單靈活、檢測成本低、檢測通量高，更易被科研人員掌握并能在通用分子實驗室中實現(xiàn)，特別適用于需要對大量個體進(jìn)行SNP標(biāo)記開發(fā)及分型的遺傳圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)發(fā)育分析及群體遺傳學(xué)等研究。因此，MiddRAD-seq在農(nóng)業(yè)分子育種、進(jìn)化生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價值和推廣前景。

　　研究以 “Development of a universal and simplified ddRAD library preparation approach for SNP discovery and genotyping in angiosperm plants”為題發(fā)表于Plant Methods上。 鏈接：http://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-016-0139-1 本研究得到國家自然科學(xué)基金項目（31470322 、31430011）的支持。

MiddRAD（a）與ddRAD（b）實驗流程圖